子痫前期（PE）胎盘五组学整合
方法学参考框架

六条最关键的战略结论——含对客户两条机制主线的诚实评估、真正的创新点，以及必须立刻修正的方法陷阱。

5 路并行深度文献调研（≈300 次检索 / ≈100 次全文抓取），每路强制只回报检索验证过的真实文献，并对与项目假设冲突的证据如实标注。

0.1 五路并行调研分工

0.2 证据分级图例

✅ 已抓取 页面实时抓取、题录确认（多为全文）  ◐ / ⚠️ 部分 题录经 PubMed/DOI 确认，但正文被登录墙挡——页内数值引用前复核  📄 预印本 未同行评审，标注为假设生成  ❌ 不存在 检索后确认不存在

0.3 关键诚实声明（须回传项目组）

五层数据不是「拼成一个大模型」，而是围绕三锚点组织：scRNA 参考（细胞枢纽）、共享空间坐标系（空间枢纽）、样本身份（因子枢纽）。

                     ┌─────────────────────────────────────────────┐
                     │        样本身份锚（8 对配对 · 早/晚发）       │
                     │   pseudobulk-scRNA · DIA-NN 蛋白 · 血清代谢   │
                     │      niche-聚合 Visium · niche-聚合 AFADESI   │
                     │            → MOFA+（多组）/ DIABLO            │
                     └───────────────▲─────────────────────────────┘
                                     │ 样本级因子整合
   单细胞参考锚（细胞枢纽）          │           空间坐标锚（空间枢纽）
   65,828 细胞 / 12 类              │           Visium ⟷ AFADESI 共配准
   EVT/SCT/VCT + 代谢指纹 ──映射──► Visium spot ──niche──► 与 563 代谢物融合
   scMetabolism→scFEA/Compass       │           (SpatialMETA / SpaMTP)
   →MEBOCOST(代谢物通讯)            │           三层桥: 代谢物→酶蛋白→转录本
                                     ▼
                          机制 → 靶点 → 逆转药物
                (网络传播/HotNet2 → CMap/L1000/drug2cell)

1.2 明确「不适用」的方法（避免走弯路）

1.3 八阶段总流程

（第 8 阶段「细胞通讯」贯穿始终，详见 §2 Stage 8。）

每阶段：目标 → 推荐工具 → 文献锚点 → 本项目要点/坑。

Stage 0 · 全局设计与 QC 门禁（先冻结，再分析）

• 组别标反坑：原始 h5ad obs['group'] 标反，一律按样本前缀 C=PE / Z=对照 重设；早/晚发 C_E=C3,C5 / C_L=C1,C2 / Z_E=Z4,Z5 / Z_L=Z2,Z3。
• 统计生命线（最重要一条）：PE-vs-对照差异走 per-sample × per-subtype pseudobulk + 配对/混合模型（edgeR/DESeq2 + limma-voom，样本为独立单位）。禁用 per-cell Wilcoxon。
• 组成 ≠ 表达（Campbell 2023, Commun Biol）：每个发现同时报告 (a) 细胞/亚型比例变化 与 (b) 亚型内表达变化。注意真实张力——泛研究(term) 显示 PE EVT 过多，而绒毛聚焦的空间 PE 研究显示 SCT↓/VCT+成纤维↑（Wei 2025）；按发病亚型与取样部位分辨，勿平均掉。
• 平台/SCT 捕获坑（Admati 2025, Placenta）：液滴 scRNA 严重低采样多核成熟 SCT 且产生环境 RNA；snRNA 捕获 SCT 更好但漏掉应激/免疫信号。→ 跑环境校正（CellBender/SoupX），SCT 主线表达须空间验证。
• 全女胎 = 优势：免去 XIST/Y 连锁性别混杂，明确写成无协变量优势。

Stage 1 · 单细胞参考 + 代谢指纹

注释 65,828 细胞 / 12 类，解析 EVT/SCT/VCT。参考锚定：term 用 Pique-Regi 2019 与 PE 数据集（Admati 2023、Campbell 27 类参考）做标签迁移，first-trimester 用 Vento-Tormo 2018 / Arutyunyan 2023 / Ounadjela 2024 设定轨迹方向与 EVT 侵袭终点。

代谢刻画：scMetabolism（KEGG/Reactome 快速分诊）→ scFEA + Compass（每亚型通量，两者互比）→ MEBOCOST（12 类间代谢物→感受器通讯）。输出一份可在 AFADESI/血清中验证的分泌/消耗代谢物 + 通量状态清单。

Stage 2 · scRNA → Visium 映射

• cell2location（主）：层次贝叶斯 NB，估计每 spot 绝对丰度，显式建模跨 8 切片批次，对稀有/精细类型(EVT/SCT/VCT)敏感。
• RCTD/spacexr（正交校验）：跨平台归一化 + doublet 模式。
• DestVI（连续态）：建模亚型内连续状态，直击 VCT→SCT 分化与 EVT 侵袭梯度——本项目双主线的核心。

Stage 3 · 空间 niche 分割

BANKSY（主, Nat Genet 2024）/ GraphST（Nat Commun 2023）：均可跨 8 切片批次校正联合聚类；BANKSY 单一 λ 旋钮在「细胞分型↔域分割」间滑动。辅助 BayesSpace（亚 spot 分辨率）、Squidpy（邻域富集/共现）、Hotspot/SpatialDE（空间可变基因/模块）。至少定义 3 域：(i) SCT 屏障面、(ii) VCT+基质绒毛核、(iii) EVT 柱/基板侵袭前沿——EVT 主线映射到 (iii)，SCT 主线映射到 (i)。

Stage 4 · 空间转录组 ⟷ 空间代谢组融合（最难、最具创新与投稿价值）

• 配准（在 H&E 组织学上配，不要直接配离子图）：MIIT/GreedyFHist（GigaScience 2025，仿射+微分同胚，中位 TRE ~21 µm，把 MSI 像素聚合进 55 µm Visium 六边形）或 MAGPIE（Nat Commun 2025，地标/TPS，DESI 验证过 → 适配 AFADESI 这一 ambient DESI 家族源）。报告配准误差 TRE(µm)——该领域缺报告标准，报了就是加分项。
• 统计融合：SpatialMETA（Nat Commun 2025，唯一在 AFADESI+Visium 上做过基准的工具，CVAE 共享隐空间+跨样本批校正）和/或 SpaMTP（Seurat 原生）。跨组学基因-代谢物关联用 MANTIS（空间自相关校正）。
• 三层验证叙事（本项目最强「有机整合」故事）：把 DIA-NN 蛋白组当酶层，做「代谢物 → 酶蛋白 → 转录本」的反应级连接（Reactome）——这正是 Sun 2019/2023 的做法。
• 有机验证判定：把 Stage-1 推断的通量/分泌代谢物叠加到 AFADESI 实测图上、在匹配 niche 内比对（如滋养层糖酵解通量↑ 处乳酸离子↑）。这一致性就是跨组学证据。
• 归一化坑（Huang 2025, Anal Chem）：仅 TIC 归一欠校正批次/基质效应；加氘代内标可把变异降到 <12%，配合 ComBat/WaveICA/NormAE CV<10%。
• 注释置信度：AFADESI 用 METASPACE/pySM（报 FDR，如 10%），默认 Schymanski Level 4/3；仅对经在组织 MS/MS 或匹配自测提取物 LC-MS/MS 的离子升级到 L1–2。最高性价比升级 = 建胎盘专属 DDA LC-MS/MS 参考库 + AFADESI 加合物库（Zhu 2022）。

Stage 5 · 样本级多组学因子整合

组装样本匹配矩阵（n=8）：pseudobulk-scRNA、DIA-NN 蛋白、血清代谢、niche 聚合 Visium、niche 聚合 AFADESI。MOFA+（多组：早发 vs 晚发）→ 无监督 PE 因子（共享 vs 组学特异）；DIABLO（mixOmics）→ 有监督、交叉验证的五层生物标志物面板（守小 n 稳定性，n=4/组蛋白组尤其敏感）。方法选择由基准撑腰：Cantini 2021、Leng 2022。

Stage 6 · 机制 → 可成药靶点

种子 = 顶因子载荷 + niche 差异特征 → 网络传播（Cowen 2017 框架）/ HotNet2（PPI/代谢网络热扩散）→ 连通「核心失调模块」+ hub 可成药节点。去风险栈：Open Targets（可成药性/安全性）→ DGIdb 5.0/ChEMBL → 遗传支持按因果基因置信度加权（Minikel 2024：相对成功率 2.6×）对 PE GWAS（McGinnis 2017 FLT1；Honigberg 2023 NPR3/FURIN）→ 药靶 cis-MR 定调节方向。阳性对照须自证 FLT1/sFLT1 排顶。

Stage 7 · 逆转小分子（详见 §4 阈值修正）

ASGARD（主, Nat Commun 2023）：单细胞/分区分辨的 signature-reversal；OCTAD/sRGES（有界分数，正交校验）。强制负对照（Koudijs 2023）：回归掉泛毒性/抗增殖 signature，否则只会重新发现非特异细胞毒剂。诚实声明：L1000 参考细胞系几乎无滋养层/蜕膜——逆转命中只是待验证计算假设。

Stage 8 · 细胞通讯（避免假阳性的分层最佳实践）

1. 共识秩聚合主干：LIANA+（Nat Cell Biol 2024）——原生融合空间转录+空间代谢+蛋白，做 PE-vs-对照重布线。
2. 置换特异性：CellPhoneDB v5（DE 模式+空间微环境）/ CellChat（通路级聚合）。
3. 表达比例门：丢弃在相关细胞类型 <~10% 表达的配受体对。
4. 强制空间共定位：SpatialDM/stLearn/COMMOT/Squidpy ligrec/LIANA+ 局部指标——发送/接收细胞永不相邻的 LR 对按构造即假阳性。
5. 下游调控佐证：NicheNet——保留其预测靶基因确在 PE 接收细胞被诱导的配体。
6. 蛋白/代谢跨组学确认 + 样本级/pseudobulk 重复感知差异；短名单做 co-IF/RNAscope 湿验证。

诚实重构 · 本次调研最高价值部分。两条主线的终点/现象扎实，但具体因果方向分别「与文献相悖」与「未被检验」——框架的做法是把方向变成可检验的实验设计，用组学去测方向，而非用组学去证先验。

3.1 主线1 · 脂盾/铁死亡：方向须实测，勿作先验

为何本质上是双向的（以及如何挽救主线1）：「醚脂」非单一类别，通路在 PEDS1/TMEM189 处分叉——plasmanyl 型 PUFA-醚-PE（需 GNPAT/AGPS/FAR1）= 促铁死亡底物；plasmenyl 型乙烯基醚缩醛磷脂（脱饱和后）= 可能保护（牺牲性 ROS 阱，Zoeller 1999）。GNPAT/AGPS 位于分叉上游、两池共需，敲低同时抹掉两池，净方向取决于场景。唯一支持项目方向的 Perez PLoS Genet 2022，其作者也明确把敏感化归因于下游 SFA/MUFA 失衡，而非乙烯基醚抗氧化盾。

五组学检验表（主线1）

3.2 主线2 · Retromer/sFlt-1：未证假设，须配扰动

三条须处理的复杂性：

1. PE 中 sFlt-1 主要是剪接体、非脱落胞外域：主导胎盘物种是 sFlt1-e15a（灵长特异、SCT；Sela 2008；Palmer 2015），经高尔基分泌，非膜 Flt-1 回收/降解产物。唯一明确的 sFLT1 分泌路线是 clathrin/AP1/STX6/ARF1→RAB27A（Kinghorn 2023），Retromer/SNX 明确缺席。
2. Retromer 已知 RTK 作用方向相反：对 EGFR，Retromer 救援受体免于降解、促回收，VPS35 缺失降低稳态受体（Yang 2022；Yu 2023）。若 Flt-1 类 EGFR，Retromer 缺失应减少膜 Flt-1，而非增加可溶诱饵。
3. 诱饵「回收 vs 降解」方向本身不明：把 Flt-1 从降解转走会升还是降可溶 sFlt-1，并不显然。

可信脚手架（为何仍值得测）：ESCPE-1（SNX1/2+5/6，即主线2 的 SNX1）逆向分选 neuropilin-1（VEGFR1/2 共受体）及 MET/EPHA2（Simonetti PNAS 2022）；SNX17 控 VEGFR 溶酶体降解（Tang 2025）；VPS35 胎盘高表达。

五组学检验表（主线2）

3.3 整合钩子：铁死亡 → sFlt-1 汇聚

可发表的严谨骨架，映射客户的 NCS / STS / 收敛门禁设计，并诚实重接三组随意阈值。

4.1 阈值诚实修正（务必替换客户原始阈值）

4.2 七阶段可发表流程

• 每层经典图：UMAP+轨迹/速率（滋养层双分叉）、Visium niche 空间图+解卷积饼、AFADESI 离子空间图与基因/通量叠加、MOFA 因子方差分解+载荷、DIABLO circos、通量 vs 实测代谢一致性面板、逆转分数瀑布+分区 STS 热图。
• 整合叙事图：一张贯穿五层的「机制→靶点→药物」总图（枢纽-辐条 + 铁死亡→sFlt-1 汇聚）。
• 矢量导出：全部 SVG/PDF，走 scanpy/Squidpy/MOFA/mixOmics 生态；配色/字号统一，图内标注配准误差、FDR、n 与统计单位（样本级）。
• 图逻辑参考：Sun 2023（代谢物-基因网络+MSI 叠加）、Arutyunyan 2023（空间 niche+轨迹在位）、Li 2025 Cell（分区导向逆转）。

立刻修正（对外文档/方案）

• 删除「MITAC」引用 → 改 SpatialMETA / SpaMTP / MIIT-GreedyFHist / MAGPIE。
• 删除 AFADESI「5 µm」措辞 → 写实际 ~30–100 µm。
• 逆转阈值 NCS<−0.6 → τ≤−90+FDR；STS/收敛门禁按 §4.1 改。

分析设计红线

• 组别按 C=PE / Z=对照 重设（已知坑）。
• 一切 DE 走 per-sample pseudobulk + 配对混合模型；报告比例 vs 表达两套。
• 脐血按 FGR/SGA 分层。
• 早/晚发全程分层。
• SCT 主线表达须空间验证（液滴 scRNA 低采样 SCT）。

须实测方向 / 补数据（勿作先验）

• 主线1：脂质组学分池 plasmanyl vs plasmenyl，配 ferrostatin 挽救，测方向。
• 主线2：配 VPS35/SNX1 敲低扰动 + 异构体分辨 FLT1（e15a），单靠相关性不成立。
• 保留受控的「铁死亡→sFlt-1」空间共定位汇聚检验。
• 采购/自建胎盘特异 eQTL/pQTL（MR 前置）；建 AFADESI 胎盘专属注释库。

真实可验证，按主题组织；最核心、载重最大者。标 📄=预印本、◐=正文付费墙（数值引用前复核）。完整题录/DOI/URL 见各路调研原始报告。